Напишем:


✔ Реферат от 200 руб., от 4 часов
✔ Контрольную от 200 руб., от 4 часов
✔ Курсовую от 500 руб., от 1 дня
✔ Решим задачу от 20 руб., от 4 часов
✔ Дипломную работу от 3000 руб., от 3-х дней
✔ Другие виды работ по договоренности.

Узнать стоимость!

Не интересно!

Выделение больших количеств ДНК плазмид, очистка.

Для выделения плазмидной ДНК пользуются многими методами. Все они включают три основных этапа: рост бактерий и амплификацию плазмиды; сбор бактерий и их лизис; очистку плазмидной ДНК.

В этих методах очистки используют два основных различия между ДНК Escherichia coli и плазмидной ДНК:

1) хромосома Е. coli по размеру много больше ДНК плазмид. используемых в качестве векторов;

2) основная масса ДНК Е. coli выделяется из клеток в виде фрагментированных линейных молекул, тогда как большинство плазмидной ДНК экстрагируется в виде ковалентно замкнутых кольцевыхмолекул.

Большинство методов очистки включают осаждения, при которых из препарата удаляются преимущественно длинные цепи ДНК Е. coli. Методики эти основаны также на использовании свойств кольцевой замкнутой ДНК. Каждая из комплементарных цепей плазмидной ДНК представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, поэтому цепи нельзя отделить друг от друга (не разорвав одну из них) в тех условиях, при которых происходит разрыв большинства водородных связей в ДНК, например при нагревании или при выдерживании в умеренно щелочных растворах (до рН 12,5). При охлаждении или возвращении к нейтральному рН замкнутые кольцевые молекулы вновь принимают нативную конформацию, тогда как ДНК Е. coli остается денатурированной.

Плазмидная ДНК ведет себя отлично от ДНК Е. coli также и при равновесном центрифугировании в градиентах хлористого цезия, содержащих какой-нибудь интеркалирующий краситель. Ковалентно замкнутые кольцевые ДНК связывают меньше такого красителя, чем линейная ДНК, и потому в градиентах хлористого цезия, содержащих интёркалирующий агент, оказываются в зонах с более высокой плотностью.

Плазмидную ДНК выделяют из больших объемов культуры лишь в тех случаях, когда нужны значительные ее количества (например. в опытах по гибридизации для отбора специфических мРНК или когда нужно пометить 5'-концы фрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы).

Чем меньше плазмида, тем лучше достигаемые результаты. С увеличением молекулярной массы плазмиды ее свойства становятся все ближе к свойствам ДНК хозяина. Выделение плазмид,  размер которых превышает 25 kb, сильно затрудняется и выход оказывается невысоким. Однако все плазмиды, обычно используемые при клонировании, относительно невелики.  


Orgy