Напишем:


✔ Реферат от 200 руб., от 4 часов
✔ Контрольную от 200 руб., от 4 часов
✔ Курсовую от 500 руб., от 1 дня
✔ Решим задачу от 20 руб., от 4 часов
✔ Дипломную работу от 3000 руб., от 3-х дней
✔ Другие виды работ по договоренности.

Узнать стоимость!

Не интересно!

Перенос с геля на фильтры по Саузерну.

Локализация отдельных последовательностей ДНК в фрагментах обычно устанавливается методом переноса, предложенным Саузерном. Фрагменты ДНК, разделенные по размерам с помощью агарозного гель-электрофореза, сначала денатурируют, а затем переносят на нитроцеллюлозный фильтр и иммобилизуют. При переносе на фильтр относительные положения фрагментов ДНК в геле сохраняются. ДНК, связанную с фильтром, гибридизуют с ДНК или РНК, меченными 32Р, и на радиоавтографе находят положение любых полос, комплементарных радиоактивному зонду.

Перенос ДНК с агарозных гелей на нитроцеллюлозную бумагу:

1. По завершении электрофореза окрасьте ДНК бромистым этидием и сфотографируйте гель. Чтобы определить нуклеотидную последовательность вставки с помощью гибридизации по Саузерну, вполне достаточно 0,2 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК.

2. Перенесите гель в стеклянный кристаллизатор и удалите лезвием все ненужные участки геля.

3. Денатурируйте ДНК, выдержав гель в нескольких объемах 1,5 М NaCl и 0,5 М NaOH в течение 1 ч при комнатной температуре с постоянным перемешиванием или качанием.

4. Нейтрализуйте гель, поместив его в 1 М трис-НС1, рН 8,0, и 1,5 М NaCl (несколько объемов) на 1 ч при комнатной температуре с постоянным покачиванием или перемешиванием.

5. Поместить обернутую ватманом ЗММ подставку в большой кристаллизатор. Подставка должна быть длиннее и шире, чем гель. Налейте в чашку буфер почти до верха подставки.

6. Переверните гель нижней стороной кверху. Положите его на мокрую бумагу ЗММ. Между бумагой и гелем не должно быть пузырьков воздуха.

7. Поместите мокрый нитроцеллюлозный фильтр на гель.

8. Намочите в буфере два листа бумаги ватман ЗММ, вырезанных точно по размеру геля, и положите их поверх нитроцеллюлозного фильтра.

9. Нарежьте стопку бумажных полотенец (высотой 5— 8 см) немного меньшего размера, чем листы бумаги ЗММ, и поместите их на эти листы. На стопку полотенец поставьте стеклянную чашку с грузом 500 г. Вся эта процедура необходима для того, чтобы вызвать движение жидкости из резервуара через гель и нитроцеллюлозу. При этом фрагменты ДНК элюируются из геля и  переходят на нитроцеллюлозную бумагу.

10. Перенос ДНК должен продолжаться 12—24 ч.

11. Снимите полотенца и бумагу ЗММ с геля. Переверните обезвоженный гель и фильтр и положите их (гель сверху) на сухой лист бумаги ЗММ. Отметьте положение лунок геля на фильтре очень мягким карандашом или шариковой ручкой.

12. Снимите гель. Дайте стечь с фильтра избытку жидкости и высушите его при комнатной температуре на листе бумаги ЗММ. Поместите сухой фильтр между двумя листами бумаги ЗММ и прогрейте его при 80 °С в вакууме в течение 2 ч.

Перенос с геля на фильтры по Саузерну.


Orgy