Напишем:


✔ Реферат от 200 руб., от 4 часов
✔ Контрольную от 200 руб., от 4 часов
✔ Курсовую от 500 руб., от 1 дня
✔ Решим задачу от 20 руб., от 4 часов
✔ Дипломную работу от 3000 руб., от 3-х дней
✔ Другие виды работ по договоренности.

Узнать стоимость!

Не интересно!

Основные этапы молекулярного клонирования.

Клонирование геновэто процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- или эукариотических. С информационной РНК, выделяемой из однотипных клеток организма, снимают ДНК-копии (кДНК), которые затем вводят в реципиентные клетки, и амплифицируют. Клонирование ДНК in vivo включает 4 этапов:

4) трансформация с помощью вектора организма хозяина;

5) скрининг на рекомбинантный вектор

6) отбор интересующих исследователя клонов.

Реципиентные клетки – клетки, выбранные для клонирования гена, могут быть как про-, так и эукариотическими.

мРНК выделяют из клеток или тканей, в которых экспрессируется искомый ген.

Синтез ДНК - копий осуществляется ферментом РНК-зависимой ДНК-полимеразой. Чтобы этот

фермент начал работать, требуется короткая одноцепочечная ДНК-затравка; для этой цели, как правило, используют oligo(dT). Затравочная ДНК самопроизвольно образует двухцепочечный комплекс с отрезком poly(dA).

Деполимеризацию исходной РНК-цепочки осуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНК

устойчивы к обработке щелочью, а РНК полностью деполимеризуется. Получившаяся в результате ДНК является одноцепочечной.

Двухцепочечную (дц) кДНК получают путем достраивания оц-кДНК до двухцепочечной формы, выполняемого ферментом ДНК-полимеразой I. Такую кДНК можно встраивать в вектор.

Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.

Плазмиды — это встречающиеся в клетках внехромосомные элементы, представляющие собой замкнутые кольцевые молекулы дц-ДНК. Чтобы включить кДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды надо «разомкнуть». Для этого плазмиды подвергают воздействию рестриктаз.

Рестриктаза - разрезает дц-ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, называемым участками рестрикции.

Сшивание (лигирование) — процедура, в ходе которой чужеродная ДНК встраивается между (или сшивается с двумя концами плазмидной ДНК с помощью фермента, называемого ДНК-лигазой.

Трансформация происходит после того, как рекомбинантную плазмиду добавляют к бактерии-реципиенту: плазмида проникает внутрь бактерии и включается в ее жизненный цикл.

Скрининг («просеивание») — это процедура, необходимость применения которой обусловлена тем, что в исходном препарате кДНК представлено много разных мРНК и лишь часть плазмид несет нужный нам ген.

Амплификация осуществляется благодаря тому, что в одной бактериальной клетке может синтезироваться много копий интересующей нас плазмиды, а также за счет получения большого количества клеток с такими плазмидами. После выделения и очистки плазмиды обрабатывают соответствующей рестриктазой, которая вырезает встроенные в них копии искомого гена. Амплифицированный таким образом ген можно использовать для дальнейших экспериментов в области генной инженерии.


Orgy