Напишем:


✔ Реферат от 200 руб., от 4 часов
✔ Контрольную от 200 руб., от 4 часов
✔ Курсовую от 500 руб., от 1 дня
✔ Решим задачу от 20 руб., от 4 часов
✔ Дипломную работу от 3000 руб., от 3-х дней
✔ Другие виды работ по договоренности.

Узнать стоимость!

Не интересно!

Получение 32Р-гибридизационных зондов

Обратная транскриптаза может быть использована для синтеза на матрицах РНК или одноцепочечной ДНК зондов, применяемых в экспериментах по гибридизации. Затравками в таких реакциях могут служить oligo (dT) или набор большого числа случайно выбранных олигодезокси-нуклеотидов («рассеянные» олигонуклеотиды). Разнообразие этих олигонуклеотидов достаточно велико, чтобы некоторые из них оказались комплементарными последовательностям оснований в матричной нуклеиновой кислоте. Кроме того, «рассеянные» олигонуклеотиды могут служить затравками при использовании в качестве матрицы любой одноцепочечной ДНК или РНК. В отличие от этого oligo (dT) связываются только с последовательностями poly (А), что приводит к синтезу ДНК, в которой преимущественно представлены последовательности, комплементарные 3' концу мРНК-матрицы.

Для синтеза меченных 32Р зондов с высокой удельной активностью на матрицах одно-цепочечных ДНК или РНК:

К 1,0 мкг матрицы (линейной двухцепочечной или одноцепочечной ДНК или РНК) добавляют 10 мкл раствора ДНК-затравки и 2 мкл раствора каждого из немеченых dNTP, 250 пмоль [a-32P]dNTP. Перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Затем добавляют ЭДТА. Отделяют ДНК от невключившихся dNTP на колонках с сефадексом G-50 хроматографией.

Гибридизационные зонды, синтезированные с помощью обратной транскриптазы на ДНК, представляют собой одноцепочечные копии матриц:

Получение 32Р-гибридизационных зондов

Однако зонды, получаемые на матрицах РНК, включают и одноцепочечные, и двухцепочечные молекулы, которые синтезируются с помощью двух различных механизмов:

Получение 32Р-гибридизационных зондовИз двух возможных реакций беззатравочный синтез второй цепи протекает с существенно меньшей эффективностью, и молекулы со шпильками составляют менее 2—3% общего количества меченной 32Р ДНК. При необходимости синтез второй цепи (как беззатравочный, так и с экзогенной затравкой) можно ингибировать, добавляя в реакционную смесь актиномицин D в конечной концентрации 1 мг/мл. В присутствии актиномицина D включение [a-32P]dNTP в ДНК уменьшается примерно на 50%.


Orgy