Напишем:


✔ Реферат от 200 руб., от 4 часов
✔ Контрольную от 200 руб., от 4 часов
✔ Курсовую от 500 руб., от 1 дня
✔ Решим задачу от 20 руб., от 4 часов
✔ Дипломную работу от 3000 руб., от 3-х дней
✔ Другие виды работ по договоренности.

Узнать стоимость!

Не интересно!

Синтез кДНК и ее клонирование

Ферментативный синтез двухцепочечной кДНК на poly (А)+-мРНК и встраивание этой ДНК в бактериальные плазмиды стало основным методом молекулярной биологии эукариот  Наиболее распространенный метод включает:

-                   синтез первой цепи кДНК с помощью обратной транскриптазы (РНК- зависимой ДНК ПОЛИМЕРАЗЫ),

-                   удаление РНК-матрицы щелочным гидролизом,

-                   синтез второй цепи ДНК в реакции с ДНК-полимеразой I Е.coli или обратной транскриптазой (с использованием в качестве затравки шпильки на З'-конце первой цепи ДНК) и,

-                   расщепление петли, связывающей первую и вторую цепи кДНК, нуклеазой S1, специфически разрушающей одноцепочечные участки нуклеиновых кислот.

Синтез первой цепи кДНК

При работе с гетерогенными популяциями мРНК используют следующие условия:

-Обратная транскриптаза

- рН 8,3

-Одновалентные катионы (При использовании ионов калия получают более длинные транскрипты, чем в случае ионов натрия) и двухвалентные катионы (Двухвалентные катионы абсолютно необходимы для обеспечения активности обратной транскриптазы. Ферментативная активность отсутствует при концентрациях ионов Mg2+<4 мМ)

-Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты  (Для эффективного синтеза кДНК особенно важно использовать высокие концентрации каждого из четырех дезоксирибону. Если концентрация хотя бы одного из них падает ниже 10—50 мкМ, выход полноразмерных транскриптов значительно уменьшается)

Синтез второй цепи кДНК

На 3'- концах одноцепочечных кДНК могут образовываться структуры типа шпилек, которые можно использовать в качестве затравки при синтезе второй цепи кДНК с помощью ДНК-полимеразы I E.coli или обратной транскриптазы.

Молекулярное клонирование двухцепочечной кДНК

Существует множество методов связывания двухцепочечной кДНК с плазмидными векторами. К наиболее распространенным относятся следующие методы:

1. Добавление к двухцепочечной к ДНК и к плазмидной ДНК комплементарных гомополимерных последовательностей. За счет образования водородных связей между комплементарными гомополимерными «хвостами» вектор и двухцепочечная кДНК соединяются, образуя открытые кольцевые гибридные молекулы, способные трансформировать клетки Е. coli.

2. Присоединение синтетических связывающих участков (линкеров) к концам двухцепочечной кДНК. После расщепления подходящей рестриктазой молекулы кДНК встраивают в плазмидную ДНК, также расщепленную соответствующим ферментом.

Первоначально клонирование кДНК использовалось для получения копий таких мРНК, как глобиновая или овальбуминовая, присутствующих в клетке в больших количествах. В подобных случаях интересующая исследователя РНК составляет 50—90% всей poly (А)+-цитоплазматической РНК, выделенной из клеток определенных специфических типов. Поэтому никакой дальнейшей очистки специфических типов мРНК перед синтезом двухцепочечной кДНК и ее клонированием не требуется.

Для идентификации клонов с кДНК, соответствующими таким мРНК, искомые последовательности ДНК в трансформированных бактериальных клетках выявляют с помощью гибридизации с нуклеиновыми кислотами. Гибридизационные зонды представляют собой либо меченную 32Р одноцепочечную кДНК, синтезированную in vitro с помощью обратной транскриптазы на матрице мРНК, богатых представляющими интерес последовательностями, либо частично фрагментированную мРНК с концевой меткой. Можно считать, что изучаемые последовательности мРНК представлены в клонированных двухцепочечных кДНК и в гибридизационном зонде пропорционально частоте их встречаемости в исходной популяции. В случае овальбумина и глобина и им подобных белков вероятность того, что колония, интенсивно гибридизующаяся с зондом, содержит искомые последовательности ДНК, достаточно велика.


Orgy